论文题目：富氢水对小鼠脓毒症胰腺损伤的改善作用

　　论文来源：《天津医药》2021年8月第49卷第8期

　　应用范围：富氢水应用

　　论文作者：李悦娴1 ，秦树存2 ，张锦1△

　　作者单位：1中国医科大学附属盛京医院麻醉科(邮编110004);2山东第一医科大学动脉粥样硬化研究所，泰山氢生物医学研究院

　　中文摘要：目的 探讨富氢水(HRS)对脂多糖(LPS)诱导的小鼠脓毒症胰腺损伤的影响及可能机制。方法 采用LPS尾静脉注射的方法建立小鼠脓毒症胰腺损伤模型。按随机数字表法将C57BL/6J雄性小鼠分为对照组、模型组(LPS组，LPS 5 mg/kg尾静脉注射)和HRS处理组(LPS+HRS组，LPS造模1 h后HRS 10 mL/kg腹腔注射)，每组6只。制模后观察各组小鼠行为学表现，24 h后对各组小鼠进行胰腺组织苏木素伊红(HE)染色，并于显微镜下进行改良Schmidt组织病理学评分，酶联免疫吸附测定(ELISA)法检测血清淀粉酶含量、胰腺组织中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、髓过氧化物酶(MPO)和丙二醛(MDA)水平。结果 与对照相比，LPS组小鼠表现为嗜睡、寒战、行动迟缓，梳毛活动减少，并出现严重腹泻;胰腺组织出现水肿、炎性细胞浸润、出血和坏死，各项改良Schmidt组织病理学评分及总分升高;血清淀粉酶水平升高，胰腺组织中TNF-α、IL-6、MPO和MDA水平升高(均P<0.05)。与LPS组相比，LPS+HRS组小鼠嗜睡和寒战程度减轻、梳毛活动增加、腹泻减轻、排泄物减少;胰腺组织水肿、炎性细胞浸润、出血和坏死程度减轻，各项改良Schmidt组织病理学评分无明显变化(P>0.05)，改良Schmidt组织病理学评分总分降低;血清淀粉酶水平，胰腺组织中TNF-α、IL-6、MPO和MDA水平显著降低，但仍高于对照组(均P<0.05)。

　　关键字：脓毒症;胰腺疾病;氧化性应激;炎症;富氢水;胰腺损伤

　　英文摘

　　The effect of hydrogen-rich saline on pancreatic injury in septic mice

　　LI Yue-xian1 , QIN Shu-cun2 , ZHANG Jin1△

　　1Department of Anesthesiology, Shengjing Hospital of China Medical University, Shenyang 110004. China; 2 Institute of Atherosclerosis, Shandong First Medical University, Taishan Hydrogen Biomedical Research Institute △Corresponding Author E-mail: zhangj_sj@163.com

　　Abstract: Objective To investigate the effect of hydrogen-rich saline (HRS) on endotoxin (LPS)-induced pancreatic injury in mice with sepsis and its possible mechanism. Methods The mouse model of pancreatic injury of sepsis was established by tail intravenous injection of LPS. Male C57BL/6J mice were randomly divided into 3 groups with 6 mice in each group. They were control group, model/LPS group (LPS 5 mg/kg tail vein injection) and HRS treatment/LPS+HRS group (HRS 10 mL/kg intraperitoneal injection 1 h after LPS modeling). After modeling, the behavioral manifestations were observed in three groups of mice. After 24 h, pancreatic tissue was stained with hematoxylin eosin (HE), and the modified Schmidt pancreas histopathological score was performed under microscope. The serum amylase, levels of tumor necrosis factor (TNF)-α and interleukin (IL)-6. myeloperoxidase (MPO) and malonaldehyde (MDA) in the pancreatic tissues were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results Compared with the control group, mice in the LPS group showed drowsiness, shivering, slow movement, less grooming activities and severe diarrhea. There were occurred edema, inflammatory cell infiltration, hemorrhage and necrosis in pancreatic tissues. The modified Schmidt histopathologic score increased. The serum amylase level increased, and TNF-α, IL-6. MPO and MDA levels in pancreatic tissues were also increased (P<0.05). Compared with the LPS group, the drowsiness and shivering were reduced, the combing activity was increased and diarrhea was alleviated with less excreta in the LPS+HRS group. The edema, inflammatory cell infiltration, hemorrhage and necrosis in pancreatic tissues were reduced in mice. There were no significant changes in the modified Schmidt histopathology scores between the two groups (P>0.05). The serum amylase level, and TNF-α, IL-6. MPO and MDA levels in the pancreas were significantly decreased, but which were still higher than those of control group (P<0.05). Conclusion HRS can significantly improve LPS-induced septic pancreatic injury in mice by inhibiting inflammatory response and alleviating oxidative stress.

　　Key words: sepsis; pancreatic diseases; oxidative stress; inflammation; hydrogen-rich saline; pancreatic injury

　　总结：

　　脓毒症是宿主对感染反应失调造成的一种严重全身炎症反应综合征，最终导致多器官功能衰竭和脓毒性休克，是重症感染死亡的主要原因。胰腺损伤是脓毒症重要的器官功能障碍之一。氢分子具有选择性清除羟基自由基和过氧亚硝酸盐阴离子的作用，是一种新型抗氧化剂，于2007年被首次应用于医疗领域。本课题组前期研究发现，氢分子可明显改善脓毒症诱导的肝损伤、心功能障碍和肺损伤。氢分子对脓毒症肾损伤亦有治疗作用，但对脓毒症胰腺损伤是否有改善作用却鲜见报道。本实验通过脂多糖(LPS)尾静脉注射建立小鼠胰腺损伤模型，观察氢分子对脓毒症胰腺损伤的作用。

　　LPS注射是一种简便可重复的标准化脓毒症制模方式，广泛应用于脓毒症各种器官损害的研究。本研究采用LPS尾静脉注射的方式成功建立了小鼠脓毒症的胰腺损伤模型，脓毒症小鼠出现嗜睡、寒战和腹泻等脓毒症行为学表现。此外，本研究结果显示，脓毒症小鼠的胰腺组织学表现为水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死，各项改良Schmidt组织病理学评分及总分、血清淀粉酶升高，与既往研究报道的脓毒症胰腺损伤的病理改变一致，提示在LPS诱导的脓毒症中存在严重的胰腺损伤。

　　氢分子是自然界中最小的分子，可穿透细胞膜和细胞器膜，作用于细胞核和线粒体等其他药物难以到达的靶点，可选择性清除人体内有害的活性氧(ROS)而不干扰人体内正常的氧化还原反应，且终产物为水，无毒无害，因此被众多学者应用于各种氧化损伤和炎症相关疾病的治疗研究中，包括脓毒症器官损伤、胰腺炎、缺血再灌注损伤、阿尔茨海默症和动脉粥样硬化等。HRS是采用高压物理溶解的方式制成的富含氢分子的水溶液。本研究结果显示，HRS处理后小鼠的嗜睡、寒战和腹泻等行为学表现有所减轻，胰腺组织水肿、炎性细胞浸润、出血及坏死程度降低、总改良Schmidt组织病理学评分和血清淀粉酶水平降低，提示HRS可明显改善内毒素诱导的小鼠胰腺损伤。与LPS组相比，LPS+HRS组小鼠胰腺组织水肿、炎性细胞浸润、出 血及坏死的各项改Schmidt组织病理学评分无明显变化，推测可能是样本量较小的原因;但改良Schmidt组织病理学评分总分降低，改良Schmidt组织病理学评分总分更能评价胰腺组织的整体损伤程度。

　　炎症是脓毒症的重要病理之一。LPS通过与脂多糖结合蛋白(LBP)结合形成 LPS-LBP复合物，活化Toll样受体4/核因子-κB(TLR4/NF-κB)通路， 促进炎性因子释放，造成级联放大的炎症反应，形成脓毒症炎症反应机制。TLR4亦存在于胰腺组织中。研究发现，抑制 TLR4/NF-κB通路介导的IL-6和TNF-α表达的升高从而降低炎症反应可以改LPS诱导的脓毒症胰腺损伤。本研究结果显示，LPS组小鼠胰腺组织中IL-6和TNF-α较对照组升高，HRS显著抑制了LPS诱导的脓毒症小鼠胰腺组织中IL-6和TNF-α表达的升高，提示HRS逆转了介导脓毒症胰腺损伤中的核心炎症机制。MPO 常被用来评价中性粒细胞浸润。既往实验研究发现，在脓毒症肺损伤和胰腺炎中MPO升高。在急性胰腺炎中，胰腺组织中的中性粒细胞可形成中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，活化信号通路，参与炎症反应。本研究结果显示，在脓毒症胰腺损伤中同样存在MPO升高，HRS处理后MPO的升高被明显抑制，提示HRS可显著改善脓毒症胰腺组织中的中性粒细胞浸润，从而抑制炎症。此外，在胰腺炎中存在内源性ROS生成增多导致的过氧化水平升高。

　　本研究用MDA评价脓毒症小鼠胰腺组织的氧化应激水平，结果显示，LPS 组胰腺组织中 MDA 水平较对照组升高，HRS处理显著降低了MDA水平，提示 HRS可明显改善脓毒症胰腺组织的氧化应激损伤。

　　同时，本研究结果显示，HRS处理后血清淀粉酶、胰腺组织IL-6、TNF-α、MPO和MDA 水平仍高于对照组，提示单次10 mL/kg剂量腹腔注射的HRS并不能独立用于治疗脓毒症胰腺损伤。

　　综上所述，HRS可通过抑制炎症反应和降低氧化应激显著改善内毒素诱导的小鼠脓毒症胰腺损伤。HRS具有温和抗氧化，可穿透细胞膜和细胞器膜，以及抗炎、抗氧化、抗凋亡、抗休克，调节多种分子通路和自噬等多种作用机制，且成本低廉等优点，故具有较好的研究和应用前景。本研究尚存在不足之处，如未对HRS改善LPS诱导的脓毒症胰腺损伤的上下游信号通路进行探索，未设置脓毒症胰腺损伤多时间点和HRS多剂量观察，这将是本课题组下一步的研究方向。